T.C.

DÜZCE ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü

Sıra No PROJE SONUÇ RAPORU BİLGİ FORMU
1  Proje No :   2020.06.02.1092
2  Projenin Adı :   Biyoteknoloji uygulamaları için yeni bir pektinaz enziminin üretilmesi.
3  Projenin İlgili Olduğu Alan Adı :   Temel Bilimler Araştırma Projesi (TBAP)
4  Proje Yürütücüsü :   Doç Dr. Fatih Aktaş
5  Proje Yürütücüsü E-posta :   fatihaktas@duzce.edu.tr
7  Proje Araştırıcıları :  Doç.Dr. BARIŞ BİNAY
 
8  Projenin Başlama ve Bitiş Tarihi :   8.05.2020
  8.05.2022
9  Proje Süresi :   24
10  Ek Süre :   0
11  Ek Ödenek :   0,00
12  Projenin Bütçesi :   73.457,76
13  Toplam Harcama :   61.953,61
14  İşbirliği Yapılan Kuruluş :   Gebze Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü
15  İşbirliği Yapılan Kuruluşun Desteği :   Projemizde gerçekleştirilen laboratuvar deneyleri Gebze Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Laboratuvarlarındaki ekipman ve cihaz desteğiyle yapılmıştır.
16  Projenin Amacı:  Enzimler biyolojik katalizörlerdir. Endüstride enzimler sıkça kullanılmaktadır. Biyoteknolojik gelişmelerle birlikte enzimlerin üretilmesi hem daha kolay hem daha ucuz bir hal almıştır. Pektinaz enzimi bitkilerde bulunan pektini parçalayan enzimdir. Bu enzim hem tekstil sanayisinde hem de gıda sanayisinde kullanılmaktadır. Tekstil sanayisinde pamuklu iplik eldesinde kullanılmaktadır. Gıda sanayisinde ise meyve sularının berraklaşması ve akışmazlıklarını gidermekte kullanılmaktadır. Bu projede rekombinant DNA teknolojisi pektinaz enziminin karakterize edilip üretilmesi hedeflenmiştir. Poligalakturonazlar pektin substratlarını parçalayan bir grup enzimlerdir. Yağ ekstraksiyonu, fermente içecek üretimi, meyve suyu durultması ve atık suların giderilmesinde poligalakturonazlar kullanılmaktadır. Bu projede Epicoccum nigrum mikroorganizmasından elde edilen yeni bir pektinaz enziminin heterolog ifadesi, saflaştırılması ve kinetik analizi yapılması amaçlanmıştır.
17  Projenin Çıktıları:  P. pastoris'teki heterolog ekspresyon, yüksek verimli protein üretimi ve PTM özelliklerinden dolayı gıda işlemede on yıllardır kullanılmaktadır. S. schenckii 1099-18'den pektinolitik enzim EnPec, P. pastoris'te heterolog olarak başarılı bir şekilde eksprese edildi. Bu çalışma, EnPec ayrıntılı biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonunu açıklamaktadır. Salgı sinyali peptit tercihi, P. pastoris'te proteinlerin etkili heterolog ekspresyonu için önemlidir ve gereklidir. Son çalışmalar incelenmiş çeşitli sinyal peptitleri incelenmiştir . Örneğin, a-faktör salgılama sinyalinin endo-Beta-1,4-glukanazı eksprese ederken doğal sinyalden daha yüksek protein ekspresyon verimi gösterdiği gözlemlenmiştir. Ayrıca, monosit kemoatraktan protein-1'in ya doğal sinyal dizisi ya da alfa-faktörü salgılama sinyali ile aynı seviyede eksprese edildiği gözlemlenmiştir ve doğal sinyal ya da alfa-faktörü kullanılarak aynı ekspresyon seviyesi elde edilmiştir. Insan monosit kemoatraktan protein-I ifade ederken salgı sinyali. Doğal bir sinyal peptidi kullanmak, alkalin proteaz üretimini alfa-faktörü salgılama sinyalini kullanmaktan 1.5 kat daha fazla artırarak ekspresyon seviyesini etkilemiştir. EnPec’in moleküler ağırlıklarını değerlendirmek için SDS-PAGE analizi kullanıldı ve EnPec’nin 53 ile 58 kDa arasında moleküler ağırlıklara sahip olduğunu doğrulandı. Bununla birlikte, bir EndoH enzimi ile muameleden sonra tanımlanan çoklu bantların mevcudiyeti, farklı moleküler ağırlıklara sahipti. Sonuç olarak, EnPec’nin olası glikozilasyonunu tahmin ettiğimizde, EndoH ile muamele edildikten sonra iki bant gözlemledik. Böylece, saflaştırılmış EnPec, glikosilasyon ile translasyon sonrası modifiye edilebilir ve çoklu bulaşmış bantların glikosillenmiş olduğu varsayılmıştır. Rekombinant EnPec, optimize edilmiş indüksiyon koşulları altında BMMY ortamında büyütülen rekombinant P. pastoris X-33 kültürlerinden saflaştırıldı. SDS-PAGE, EnPec’in saflık miktarının ve seviyesinin daha sonraki çalışmalar için yeterli olduğunu göstermiştir (Şekil 4.6). Saflaştırılmış EnPec enziminin spesifik aktivitesi 184,8 U/mg olarak hesaplandı. PGA için KM ve kcat değerleri sırasıyla 0,58 mikroM ve 179 olarak hesaplandı ve projede elde edilen pektinaz enziminin ve diğer literatürdeki pektinaz enzimlerinin kinetik değerleri karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.
18  Proje Çıktılarının Bilime ve Uygulamaya Aktarılması:  Pektinolitik enzimler, farklı biyoteknolojik işlemlerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu projenin amacı, P. pastoris ifadesi kullanılarak heterolog EnPec üretimi yapmaktı. EnPec saflaştırıldı ve biyokimya ve hesaplamalı yapı modellemesi açısından geniş çapta karakterize edildi. Ticari olarak test edilmiş pektinolitik enzimlerle karşılaştırıldığında EnPec’nin berraklaştırma performansı, biraz daha iyi olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, enzimin mühendislik ve immobilizasyonunun daha verimli, düşük maliyetli ve çevre dostu uygulamalara katkıda bulunabileceğinden, yeni rekombinant EnPec’nin fermantasyon teknolojisi kullanılarak büyük ölçekte üretilmesi gerektiğini önermektedir. Daha ileri çalışmalar, protein mühendisliği tekniklerini kullanarak spesifik aktiviteyi ve substrat spesifikliğini arttırmaya odaklanmalıdır. Ayrıca, ticari enzimler içeren yeni karışımların araştırılması, enzimin sadece gıda üretiminde değil, aynı zamanda tekstil ve atık yönetimi işlemlerinde kullanım potansiyelini artırabilir. Endüstriyel uygulamada enzimlerin farklı immobilizasyon teknikleri, enzimin aktivitesini, stabilitesini, özgüllüğünü, saflığını ve daha fazlasını iyileştirebilir.
19  Proje Kapsamında Yapılan Yayınlar:  Proje kapsamında yapılan çalışmalar Uluslararası SCI indekse sahip Protein & Peptide Letters adlı dergide yayınlanmıştır. 1. Karataş E, Tülek A, Çakar MM, Tamtürk F, Aktaş F, Binay B. From Secretion in Pichia pastoris to Application in Apple Juice Processing: Exo-Polygalacturonase from Sporothrix schenckii 1099-18. Protein Pept Lett. 2021;28(7):817-830. doi: 10.2174/1871530321666210106110400. PMID: 33413052.

  Tarih: 


  İmza: